Имя материала: Патологическая анатомия

Автор: Михаил Александрович Пальцев

7.5. молекулярные основы канцерогенеза

При всем разнообразии макро- и микроскопических признаков, а также ультраструктурных, биохимических, иммунологических и генетических параметров, характеризующих новообразования, последние развиваются по определенным законам. Иными словами, у самых разных типов опухолей есть много общего на различных этапах возникновения и роста.

В основе канцерогенеза лежат нелетальные повреждения генетического аппарата (генома) клеток типа мутаций: генные, при которых изменяется количество или последовательность мононуклеотидов в пределах одного гена, или геномные, при которых изменяется число хромосом или их наборов. Во многих случаях мутации генов или генома могут быть обнаружены патологоанатомом. Повреждения генома в соматических клетках могут быть приобретенными вследствие воздействия факторов окружающей среды (химических веществ, радиации, вирусов). В клетках зародышей они могут иметь наследственный характер. Генетическая концепция канцерогенеза подразумевает, что популяция опухолевых клеток — это результат размножения, идущего от одной клетки-родоначальницы клона, претерпевшей опухолевую трансформацию. В этом состоит смысл представления о моноклональном развитии опухолей.

Установлено, что основными мишенями генетического воздействия при опухолевой трансформации являются два класса нормальных регуляторных генов: протоонкогены-промоторы (активаторы) роста клеток и канцеросупрессорные гены (антионкогены), тормозящие рост. Мутантные аллели (измененные состояния) протоонкогенов расцениваются как доминантные (преобладающие и препятствующие появлению других состояний), поскольку они трансформируют клетки, несмотря на наличие их нормальных копий. В противоположность этому обе нормальные аллели канцеросупрессорных генов должны быть повреждены для того, чтобы осуществилась трансформация. Поэтому такое семейство генов относят к рецессивным онкогенам (проявляющимся в гомозиготном состоянии, т.е. при наличии двух своих идентичных аллелей).

К третьему классу генов, тоже имеющих важное значение в канцерогенезе, относят гены, контролирующие программированную гибель клеток — апоптоз. Функция одних из этих генов узкоспецифична и подчинена только указанной цели, но некоторые гены этой группы функционируют и как протоонкогены, и как антионкогены.

В настоящее время канцерогенез представляется в виде стадийного, многоступенчатого процесса как на генетическом уровне, так и на уровне приобретения какого-либо фенотипа. Последний у злокачественных опухолей включает в себя несколько свойств: избыточный рост, инвазию, способность к ме-

Злокачественная опухоль

 

тастазированию. Эти свойства приобретаются в ходе прогресси-рования опухоли, т:е. различных изменений ее фенотипа, обычно в сторону увеличения злокачественности. Все эти изменения полностью определяются и направляются процессами, происходящими на генетическом уровне (схема 7.1).

В нижеследующих подразделах раздела 7.5 затронуты многочисленные генетические понятия и определения, известные из курса биологии. Практически все они отражены в главе 8, посвященной генетической патологии. Это можно использовать для соответствующих справок.

Учение об онкогенах. Принято думать, что гены, вызывающие злокачественные новообразования, происходят из прото-онкогенов, которые активируют в нормальных клетках физиологическую пролиферацию и дифференцировку клеток. Путь к открытию протоонкогенов оказался непростым. Вначале их обнаружили в качестве «попутчиков» в геноме быстро трансформирующих ретровирусов (РНК-содержащих вирусов), которые способны к быстрой индукции опухолей у подопытных животных и к трансформации их клеток in vitro. Молекулярное расчленение генома этих вирусов выявило наличие уникальных трансформирующих последовательностей, названных вирусными онкогенами (v-oncs) и не обнаруженных в геноме нетранс-формирующих ретровирусов. Оказалось, что последовательности v-oncs были идентичны некоторым последовательностям ДНК в нормальных клетках. Полагают, что в ходе эволюции ретровирусные онкогены подверглись трансдукции (переносу или захвату) в вирусный геном путем случайной рекомбинации (обмена) с ДНК нормальных клеток, инфицированных вирусом. Поскольку уже существовало название «вирусные онкогены», понятие «протоонкогены» (как бы предшественники v-oncs) возникло по отношению к их аналогам. В настоящее время для обозначения каждого v-onc принят трехбуквенный символ, указывающий на онкоген того вируса, из которого он был изолирован. Например, онкоген, содержащийся в вирусе саркомы линии fe, обозначается как «v-fes», а онкоген вируса саркомы обезьян (simian sarcoma) — как «v-sis». Другие протоонкогены обозначаются еще проще: «fes» и «sis», т.е. без «v».

Важно отметить, что вирусные онкогены отсутствуют в нескольких РНК-содержащих вирусах, вызывающих новообразования. Примером может служить группа так называемых медленно трансформирующих вирусов, вызывающих лейкемию у грызунов после продолжительного латентного периода. Однако механизм, с помощью которого они осуществляют опухолевую трансформацию, связан с протоонкогенами. Молекулярное исследование клеток, трансформированных такими вирусами лейкемии, показало, что провирусная ДНК всегда определяется в качестве инсерции (вставки) около протоонкогена. Вследствие такой вставки возникают структурные изменения клеточного гена, превращающие его в клеточный онкоген (с-onc). А сильные ретровирусные активаторы, вставленные в ДНК поблизости от протоонкогенов, приводят к нерегулируемой экспрессии (реализации функции) клеточного гена. Такой вид активации протоонкогена называют инсерционным.

Хотя изучение трансформирующих ретровирусов подопытных животных вызвало появление учения об онкогенах, последнее не смогло объяснить происхождение опухолей человека, которые, за редким исключением, не вызываются ретровирусами. Возник естественный вопрос, содержат ли опухоли невирусной природы онкогенные последовательности ДНК? Ответ был получен в опытах с трансфекцией ДНК (воспроизведением вируса в клетке путем введения в ее геном изолированной вирусной ДНК). После введения in vitro ДНК, выделенной из нескольких разных опухолей человека, в мышиные фибробласты, в последних развивалась злокачественная трансформация. Из чего был сделан вывод, что ДНК в спонтанно возникающих новообразованиях содержит онкогенные последовательности или онкогены. Многие из этих трансформирующих последовательностей оказались идентичны ras-протоонкогенам, предшественникам вирусных онкогенов Ha-ras и Ki-ras вируса мышиной саркомы. Другие же, например онкоген c-erb В-2, имеют совершенно иные формы последовательностей, не встречающиеся в ретро-вирусах.

Таким образом, протоонкогены могут становиться онкогенами при ретровирусной трансдукции (v-oncs) или при воздействиях, трансформирующих их in situ в клеточные онкогены (c-oncs).

Белковые продукты онкогенов. Онкогены кодируют белки, называемые онкопротеинами. Эти белки напоминают нормальные продукты протоонкогенов, но за тем исключением, что онкопротеины лишены важных регуляторных элементов, и их выработка в трансформированных клетках не зависит от факторов роста или других внешних сигнальных субстанций (по R.S.Cotran, K.Kumar, T.Collins, 1998). Чтобы лучше понять природу и функции онкобелков, следует вспомнить основные этапы физиологической клеточной пролиферации (см. главу 6): а) связывание фактора роста с его специфическим рецептором в плазмолемме; б) временная и ограниченная активация рецепторов фактора роста, которая в свою очередь активирует несколько сигнально-преобразующих белков во внутренней пластине плазмолеммы; в) передача преобразованного сигнала сквозь цитозоль через систему вторичных мессенджеров (см. главы 2 и 8); г) активация внутриядерных регуляторных факторов, вызывающих транскрипцию ДНК и деление клетки. Имея в виду эти этапы, можно установить виды онкогенов и онкобелков в качестве измененных версий их нормальных копий, а также сгруппировать их с учетом той роли, которую они играют в каскаде сигнальной трансдукции (табл. 7.5).

1. Факторы роста. Известно много полипептидных факторов роста, стимулирующих пролиферацию нормальных клеток (см. главу 6). Полагают, что ряд факторов принимает участие и в канцерогенезе. Мутации генов, кодирующих эти факторы, могут превращать их в онкогенные факторы. Например, прото-онкоген c-sis, кодирующий р-цепь тромбоцитарного фактора роста (ТцФР) был открыт в виде вирусного онкогена, содержащегося в v-sis. Позже ТцФР был обнаружен в некоторых новообразованиях человека, в основном в астроцитомах и остеосар-комах. Выяснилось, что в этих новообразованиях имеются также рецепторы ТцФР, благодаря чему возможна аутокринная стимуляция клетки. Аутокринная стимуляция рассматривается как важное звено патогенеза ряда опухолей, в большинстве которых ген фактора роста остается неизмененным, т.е. без мута-

Факторы роста

Тромбоцитарный фактор роста-р-цепь

Факторы роста фибробластов

 

sis

 

hst-1, int-2

 

Сверхэкспрессия

Сверхэкспрессия

 

Астроцитома, остеосарко-ма

Рак желудка, мочевого пузыря, молочной железы Меланома

Подпись: erb В1 erb В2 erb ВЗПодпись: finsРецепторы факторов роста

Семейство рецепто ра эпидермального фактора роста

Рецептор колоние-стимулирующего фактора (КСФ)-1

 

Сверхэкспрессия

Амплификация

Сверхэкспрессия

Точковые мутации

 

Плоскоклеточный рак легкого

Рак молочной железы, яичника, легкого, желудка Рак молочной железы

Лейкемия

Белки, участвующие в сигнальной транедукции

Связывающиеся с ГТФ

Нерецептор ная тирозинкиназа

ras

 

abl

Точковые мутации

Транслокация

Рак легкого, кишки, поджелудочной железы, различные лейкемии

Хроническая миелоидная лейкемия, острая лимфо-бластная лейкемия

Ядерные регуляторные белки

Активаторы туе N-myc

транскрипции

L-myc

 

Транслокация Амплификация

Амплификация

 

Лимфома Беркитта Нейробластома, мелкоклеточный рак легкого Мелкоклеточный рак легкого

 

 

ции. Чаще всего экспрессию и даже сверхэкспрессию генов фактора роста вызывают продукты других онкогенов, таких как ras (располагающийся вдоль пути сигнальной транедукции). Указанные продукты побуждают клетки вырабатывать большие количества факторов роста, например трансформирующий фактор роста а (ТФРа). ТФРа связан с эпидермальным фактором роста (ЭФР) и вызывает пролиферацию путем связывания с рецептором ЭФР.

Кроме c-sis, в некоторых карциномах пищеварительного тракта и молочной железы активируется группа связанных с ним онкогенов, кодирующих белки, гомологичные (сходные) с факторами роста фибробластов (ФРФ), например hst-1, int-2.

Наконец, мелкоклеточный рак легкого продуцирует бомбезино-подобные пептиды, стимулирующие пролиферацию раковых клеток.

Несмотря на то что факторы роста вызывают аутокринную стимуляцию трансформированных клеток, нужно отметить, что избыточная продукция этих факторов сама по себе недостаточна для опухолевой трансформации. Чрезмерная пролиферация клеток во всех случаях только способствует приобретению ими злокачественного фенотипа путем повышения степени риска для спонтанных (самопроизвольных) или индуцированных (чем-либо вызванных) мутаций в клеточной популяции.

2. Рецепторы факторов роста. Это — следующее звено сигнальной трансдукции. Известно несколько онкогенов, кодирующих рецепторы факторов роста. Причем в опухолях обнаружены и структурные изменения, и патологическая сверхэкспрессия этих факторов. Для того чтобы понять, как мутации могут изменить функцию рецепторов факторов роста, надо помнить, что несколько таких рецепторов являются трансмембранными протеинами со следующими доменами: наружным лигандосвя-зующим и цитоплазматическим тирозинкиназным.

При нормальном состоянии рецепторов активность киназы временно активируется путем связывания специфических для каждого рецептора факторов роста. Затем быстро наступает ти-розиновое фосфорилирование нескольких субстратов, составляющих звенья митотического каскада. При онкогенных версиях рецепторов их структура и функция обусловлены стойкой активацией тирозинкиназы в цитоплазматическом домене, но без связывания с фактором роста. Следовательно, мутантные рецепторы передают в клетку непрерывные митогенные сигналы.

Мутации, поражающие рецепторы факторов роста, приобретают одну из двух форм: укорочение рецептора или точковую мутацию. Показано, что v-erb В, трансформирующий онкоген вируса птичьего эритробластоза, кодирует мутантный рецептор ЭФР таким образом, что при этом утрачивается большинство наружных ЭФР-связующих доменов. Такое укорочение приводит к существенной активации внутриклеточной тирозинкиназы. Сходное укорочение рецептора обнаружено в некоторых астроцитомах человека. Точковые мутации (изменение одной пары оснований), активирующие c-fms, а также ген, кодирующий рецептор цитокина, колониестимулирующего фактора (КСФ)-1 (фактора, обеспечивающего формирование колоний или пролифератов клеток в культуре), выявлены в опухолевых клетках при миелоидной лейкемии. Гораздо чаще, чем мутации, нарушающие регуляторную функцию протоонкогенов, встречается сверхэкспрессия нормальных форм рецепторов факторов роста. Обычно вовлечены три члена семейства рецепторов ЭФР. Примерно в 80 \% плоскоклеточных карцином легкого, реже в раковой опухоли мочевого пузыря, пищеварительного тракта, а также в астроцитомах находится в сверхэкспрессированном состоянии нормальная форма c-erb В1, ген рецептора ЭФР. В некоторых случаях повышенная экспрессия рецептора связана с амплификацией (сверхудвоением) гена. Но в большинстве других случаев молекулярные условия для повышенной экспрессии рецептора неизвестны. В противоположность этому, ген c-erb В2 (иначе называемый c-neu), второй член семейства рецепторов ЭФР, амплифицируется в большом проценте наблюдений аденокарциномы молочной железы, яичников, легких, желудка и слюнных желез. Лиганд для c-erb В2 недавно идентифицирован, и транскрипты (единицы транскрипции, кодирующие синтез рРНК) этого нового фактора роста выявлены в тех же тканях, в которых экспрессирован рецептор.

Третий член семейства рецепторов ЭФР — c-erb ВЗ, тоже изолированный недавно, находится в сверхэкспрессированном состоянии в карциномах молочной железы. Было высказано предположение, что опухоли со сверхэкспрессией рецепторов факторов роста, например c-erb В2, могут иметь особую чувствительность к небольшим его количествам, стимулирующим рост, и, следовательно, могут быть более агрессивны. Такая гипотеза подтверждается тем, что высокие уровни белка c-erb В2 в клетках карциномы молочной железы свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе.

3. Белки, трансдуцирующие (переносящие) сигналы (см. табл. 7.5). Известно несколько онкобелков, имитирующих функцию нормальных цитоплазматических белков, переносящих сигналы. Молекулы большинства из них локализованы во внутренней пластине плазмолеммы, где они получают сигналы из среды, окружающей клетку, например при активации рецепторов факторов роста, и передают их клеточному ядру. С биохимической точки зрения эти белки гетерогенны, однако их группируют в две категории: гуанозинтрифосфатсвязующие белки (ГТФ-белки), например c-ras, и тирозинкиназы, не связанные с рецепторами, например c-abl.

Белки ГТФ включают семейство белков ras и хорошо изученные белки G. Примерно 30 \% всех опухолей человека содержат мутантные варианты белков ras. Причем для карцином толстой кишки, поджелудочной железы и щитовидной железы этот показатель еще выше. Мутация гена ras — единственное и наиболее часто встречающееся отклонение доминантных онкогенов в опухолях человека. Известно, что ras играет важную роль в стимуляции митоза (митогенезе), вызванной факторами роста. Например, блокада функции ras микроинъекцией специфических антител прерывает пролиферативный ответ ЭФР, ТцФР и КСФ-1.

Нормальные белки ras мигрируют между активированной формой, передающей сигнал, и неактивным, статическим состоянием. В неактивном состоянии белки ras связывают гуанозиндифосфат (ГДФ). Когда клетки простимулированы факторами роста или другими рецепторно-лигандными взаимодействиями, ras активируется при замене ГДФ на ГТФ. Активированный ras поочередно возбуждает действующие регуляторы пролиферации, такие как митогенактивированные протеинкиназы (МАПК) и протеинкиназа С. В нормальных клетках активная, передающая сигнал стадия белка ras скоротечна, поскольку его гуанозинтрифосфатаза (ГТФаза) гидролизует ГТФ в ГДФ, возвращая посредством этого ras в статическое состояние. Такой цикл протеина ras зависит от двух реакций: обмена нуклеотида-ми — ГДФ на ГТФ-активирующий белок ras, и гидролиза ГТФ, превращающего активный ГДФ-связанный ras в неактивную ГДФ-связанную форму. Обе реакции управляются ферментами. Освобождение связанного ГДФ из неактивного ras катализируется (ускоряется) семейством гуаниносвобождающих факторов (ГОФ).

В противоположность гену ras, сигнально-переносящая функция G-белков представляется теперь более отчетливой. Только один протеин G-белок, контролирующий активность аденилциклазы (G-a-S), расценивается как онкопротеин. Му-тантный G-a-S обнаружен в клеточных сублиниях опухолей гипофиза, надпочечников и щитовидной железы.

Молекулы тирозинкиназ, не связанных с рецепторами, как и гуанозинтрифосфатсвязывающих белков, располагаются во внутренней пластине плазмолеммы и нужны для фосфорилиро-вания внутриклеточных мишеней в ответ на действие наружных стимулов роста. Подобно протоонкогенам, кодирующим рецепторы факторов роста, мутации тирозинкиназ, не связанных с рецепторами, повышающими киназную активность, превращают их в онкогены. Мутантные формы таких тирозинкиназ, которые приобрели трансформирующий потенциал, обычно, обнаруживаются в виде v-oncs ретровирусов животных: v-abl, v-src, v-fyn, v-fes и др. Однако, кроме c-abl, они редко активируются в опухолях человека. Протоонкоген abl обладает тирозин-киназной активностью, которая угнетается противодействием регуляторных доменов. Однако эта активность проявляется при хронической миелоидной лейкемии и некоторых острых лим-фобластных лейкемиях, когда ген c-abl подвергается транслокации со своего обычного места в хромосоме 9 на хромосому 22. Здесь он сливается с частью гена bcr (break-point cluster region, зона ложного точкового кластера, т.е. скопления генов и их частей), а гибридный ген (химера) обладает мощной активностью тирозинкиназы. И хотя конкретные субстраты, которые фосфо-рилирует химера abl-bcr, неизвестны, полагают, что они регулируют пролиферацию клеток.

4. Ядерные регуляторные белки (см. табл. 7.5). Все системы и пути сигнальной трансдукции замыкаются в ядре клетки и воздействуют на отвечающие гены, которые организуют продвижение клетки через митотический цикл (см. главу 6). Репликация ДНК и деление клетки регулируются семейством генов, продукты которых локализуются в ядре, где они контролируют транскрипцию генов, связанных с ростом. Поэтому неудивительно, что гены, которые влияют на мутации, кодирующие факторы ядерной транскрипции, ассоциируются со злокачественной трансформацией. Известна внутриядерная локализация множества онкобелков, производных онкогенов туе, myb, jun и fos.

Ген туе чаще всего участвует в опухолевом процессе у человека и поэтому целесообразно рассмотреть его функции. Прото-онкоген с-тус экспрессируется фактически во всех эукариот-ных (имеющих ядра) клетках и относится к генам, отвечающим за ранние этапы роста. Он быстро подвергается индукции (включению транскрипции), когда покоящаяся клетка получает сигнал к делению (см. главу 6). Вслед за преходящим повышением содержания мРНК гена с-тус экспрессия снижается до базового уровня. Значение с-тус в пролиферации клеток обусловлено еще и тем, что торможение его экспрессии в эксперименте с помощью олигонуклеотидов предотвращает вступление клеток в S-фазу.

Молекулярные основы участия с-тус в репликации клеток полностью не ясны, но некоторые общие принципы определены (глава 8). Вслед за трансляцией белок с-тус быстро переносится в ядро. До или после этого он формирует гетеродимер с другим протеином, названным «тах». Затем комплекс с-myc/max связывается со специфическими последовательностями ДНК предположительно поблизости от генов, необходимых для пролиферации клеток. Находясь в этой важной локализации, туе активирует транскрипцию соседних генов, связанных с пролиферацией. Подлинность генов, способствующих делению и являющихся мишенями активации с помощью туе, еще должна быть установлена, но несколько кандидатов, включая ген c-sis, кодирующий р-цепь ТцФР, уже установлены. В противоположность регулируемой экспрессии гена с-тус в ходе нормальной пролиферации клеток онкогенным версиям свойственна стойкая экспрессия, а в некоторых случаях даже сверхэкспрессия белка туе. Все это может приводить к непрерывной транскрипции решающих генов-мишеней и к опухолевой трансформации. Нарушение регуляции экспрессии гена с-тус встречается при лимфоме Беркитта (D.Burkitt), В-клеточных опухолях, тогда как усиление N-myc и L-myc — в нейробластомах и мелкоклеточном раке легкого.

Активация онкогенов. Механизмы трансформации протоонкогенов в онкогены включают две большие группы процессов: изменения структуры гена, приводящие к синтезу ненормального генного продукта (онкобелка), имеющего функцию, отличающуюся от нормы, а также изменения в регуляции экспрессии гена, приводящие к усиленной и несоответствующей продукции нормального по строению белка, стимулирующего пролиферацию

Точковые мутации. Наилучший пример активации, вызванной точковыми мутациями, представляет собой онкоген ras. Известно несколько мутаций, эффективно снижающих активность ГТФазы белков ras.

Мутации гена ras обнаружены во многих новообразованиях человека. Их частота варьирует в разных типах опухолей, однако в ряде случаев очень высока. Например, точковые мутации ras обнаружены в 90 \% случаев при аденокарциномах поджелудочной железы, примерно в 50 \% — при раке толстой кишки, эндометрия и щитовидной железы, в 30 \% случаев при аденокарциномах легкого и миелоидной лейкемии. Причем мутации этого гена редки или даже отсутствуют в других распространенных формах рака, таких как карцинома шейки матки или молочной железы. Таким образом, отсутствие в ткани мутаций ras не всегда свидетельствует об отсутствии канцерогенеза. При острой миелоидной лейкемии были найдены активирующие точковые мутации и в другом гене — c-frns.

Транслокации хромосом. Перераспределение генетического материала при хромосомной транслокации (см. главы 1 и 8) обычно приводит к сверхэкспрессии протоонкогенов, но в некоторых случаях ген может также подвергаться и структурным изменениям. Сверхэкспрессия протоонкогена, вызванная транслокацией, лучше всего иллюстрируется на примере лим-фомы Беркитта. При всех вариантах этой опухоли встречается какая-либо одна из трех транслокаций, характерных для этой лимфомы и вовлекающих как часть хромосомы 8q24, в которой содержится ген с-тус, так и хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов. В нормальных локусах этих хромосом экспрессия гена туе строго контролируется и реализуется лишь в определенных стадиях клеточного цикла. При лимфомах Беркитта наиболее частая форма транслокации представлена перемещением сегмента хромосомы 8, содержащего с-тус, на 32-ю полосу плеча q хромосомы 14.

Молекулярные механизмы активации с-тус, связанной с транслокацией, различны, как различны и точки разрыва внутри гена. В некоторых случаях транслокация вызывает стимуляцию гена с-тус с помощью прилежащего иммуноглобулин-несущего гена. В других случаях она приводит к мутации регуля-торных последовательностей гена туе. При всех ситуациях кодирующие последовательности этого гена остаются интактны-ми, и поэтому он полностью экспрессируется. Постоянное обнаружение перемещенного гена с-тус в лимфомах Беркитта свидетельствует о важности его сверхэкспрессии в патогенезе этой опухоли. Это предположение нашло подтверждение благодаря обнаружению в В-клеточных лимфомах в опытах на трансгенных мышах-носителях гена туе, находившегося под контролем иммуноглобулинового усилителя.

Механизм, характерный для гена туе, встречается и при сверхэкспрессии гена bcl-2. Во всех фолликулярных В-клеточ-ных лимфомах ген bcl-2, находящийся в позиции 18q21, перемещается в позицию 14q32.

Филадельфийская хромосома, характерная для хронической миелоидной лейкемии и встречающаяся при острых лимфо-бластных лейкемиях, тоже служит примером генетического повреждения, обусловленного транслокацией. При вышеперечисленных опухолевых процессах в ходе реципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22 укороченная часть протоонкогена с-abl переносится с хромосомы 9 на зоны кластеров точечных разрывов (bcr, breakpoint cluster region) в хромосоме 22. Гибридный ген c-abl-bcr кодирует химерный (генетически соче-танный) белок, имеющий тирозинкиназную активность. Несмотря на то что транслокации при хронической миелоидной лейкемии и острых лимфобластных лейкемиях цитогенетически идентичны, они отличаются на молекулярном уровне. В первом случае химерный протеин имеет молекулярную массу 210 кДа (килодальтон), в то время как при более агрессивных острых лейкемиях путем слияния формируется несколько отличающийся белок abl-bcr с массой 180 кДа. У последнего белка активность тирозинкиназы гораздо выше, чем у первого. Последнее время патологоанатомы и цитогенетики открывают все больше и больше вариантов транслокаций.

Амплификация генов (увеличение числа, сверхудвоение генов). Активация протоонкогенов, связанная со сверхэкспрессией их продуктов, может быть результатом редупликации и многократной амплификации их последовательностей в ДНК. В результате такой амплификации в опухолевых клетках могут вырабатываться несколько сотен копий протоонкогенов. Ампли-фицированные гены можно обнаружить с помощью методики гибридизации с соответствующим образцом молекулы ДНК (см. главу 1). Кроме того, в некоторых случаях амплифицированные гены претерпевают такие цитогенетические изменения, которые можно обнаружить микроскопически. При этом находят обычно два взаимоисключающих варианта изменений: множественные, мелкие хромосомоподобные структуры, названные сдвоенными мелкими частицами и гомогенно окрашенные районы. Последние возникают при сборке новых хромосом из амплифи-цированных генов. Поскольку эти районы, содержащие указанные гены, не имеют нормального распределения полос, при бэндинге кариотипа (см. главы 1 и 8) они выглядят в виде однородных зон. Например 30—40 \% наблюдений нейробластом и карцином молочной железы сопровождаются амплификацией соответственно N-myc и c-erb В2, что служит показателем плохого прогноза. Точно такая же связь с прогнозом и амплификацией L-myc и N-myc отмечена при мелкоклеточном раке легких.

Канцеросупрессорные гены (антионкогены, опухолевые гены-супрессоры). Несмотря на то что протоонкогены кодируют белки, способствующие пролиферации клеток, продукты генов-супрес-соров ее тормозят. Однако следует иметь в виду, что физиологической функцией этих генов является регуляция пролиферации клеток, а не предупреждение формирования опухоли.

Канцеросупрессорные гены были обнаружены при изучении ретинобластомы (злокачественная нейроэпителиома сетчатки глаза), опухоли младенческого или детского периода, возникающей у одного ребенка на каждые 20 тыс. детей. Примерно 60 \% ретинобластом носят спорадический (случайный), а около 40 \% — наследственный характер. Полагают, что передача осуществляется по аутосомно-доминантному типу. При попытке объяснить, почему фенотипически идентичные опухоли имеют то спорадическую, то наследственную природу, была выдвинута гипотеза двух ударов. Кнудсон (A.G.Knudson) предположил, что в случае наследования от больного родителя передается одно генетическое изменение — «первый удар», которое имеется во всех соматических клетках ребенка. В то же время вторая мутация — «второй удар» — возникает в одной из многих клеток сетчатки, уже претерпевших первую мутацию. В случае спорадического возникновения обе мутации или оба «удара» происходят в единственной клетке сетчатки, потомки которой формируют опухоль. Гипотеза Кнудсона впоследствии обрела более конкретное выражение.

Мутации, вызывающие появление ретинобластомы, затрагивают ген Rb, находящийся в позиции 13q 14. В некоторых случаях генетическое изменение настолько велико, что оно имеет характер делеции 13ql4. Для возникновения ретинобластомы обе нормальные аллели в локусе гена Rb должны быть инактивиро-ваны — «два удара». В случае наследования дети рождаются с одной нормальной и одной дефектной копией Rb. Нормальную копию они теряют в ретинобластах при одной из форм соматической мутации (точковой мутации, межуточной делеции 13ql4 или полной утрате нормальной хромосомы 13). В случаях спорадического возникновения в одном из ретинобластов при соматической мутации утрачиваются обе нормальные аллели в Rb. Конечный результат один: та клетка сетчатки, которая утратила обе нормальные копии гена Rb, дает начало ретинобластоме. У больных с наследственной передачей опухоли существует риск возникновения остеосаркомы, а также некоторых опухолей мягких тканей. Инактивация локуса Rb отмечена и при других новообразованиях: аденокарциноме молочной железы, мелкоклеточном раке легкого, раке мочевого пузыря. Таким образом, утрата генов Rb имеет широкое этиологическое значение в развитии опухолей.

Ребенок — носитель наследованной аллели мутантного гена Rb во всех соматических клетках является совершенно нормальным и не подвержен риску канцерогенеза. Поскольку он гетерозиготен по отношению к локусу Rb, гетерозиготность для гена Rb не сопровождается повреждением клетки (гетерозигота — особь с различными аллелями в каком-либо определенном ло-кусе, а гомозигота — с одинаковыми аллелями в соответствующем локусе гомологичных хромосом). Малигнизация начинается тогда, когда клетка становится гомозиготной для мутантных аллелей или когда теряет гетерозиготность для нормального гена Rb. Ген Rb вызывает канцерогенез тогда, когда утрачены обе нормальные копии, поэтому его называют «раковый ген», т.е. не проявляющийся в гетерозиготе.

Сходным образом действует при канцерогенезе и ряд других генов (см. также главу 8). Так, один ген короткого плеча хромосомы 11 или более участвует в формировании нефробластомы Вильмса (M.Wilms), рабдомиосаркомы и гепатокарциномы. Среди более часто встречающихся опухолей утрата гетерозигот-ности в определенных локусах хромосом 13, 3, 5, 17 и 18 найдена в карциномах молочной железы (13), легкого (3) и кишки (5, 17, 18). Стойкая и неслучайная утрата гетерозиготности свидетельствует об определенной локализации некоторых канцеросу-прессорных генов: р53, АРС и NF-1, DCC, WT-1.

Ген р 5 3 картирован в позиции 17р13.1 и является единственной, наиболее частой мишенью для генетических повреждений при канцерогенезе у человека. Его гомозиготная утрата обнаружена в 70 \% случаев рака толстой кишки, в 50 \% карцином легкого и молочной железы. Мутации гена р53 не ограничиваются только эпителиальными опухолями и обнаружены также при лейкемиях, лимфомах, саркомах и нейрогенных опухолях. Несмотря на то что в большинстве случаев мутации р53 в соматических клетках являются приобретенными, описаны и наследственные формы его повреждения. Как и для гена Rb, наследование мутантного аллеля р53 при синдроме Ли-Фраумени (G.Li-Fraumeni) является предрасполагающим фактором к канцерогенезу. Однако в отличие от лиц, наследующих ген Rb, больные с синдромом Ли-Фраумени имеют высокую степень риска развития разнообразных злокачественных новообразований, включая рак молочной железы, саркомы, опухоли головного мозга.

Гены АРС и NF-1 сходны с геном Rb, тоже участвуют в патогенезе наследственных неоплазий, однако механизм их действия иной (АРС — аденоматозный полипоз кишки, NF — нейрофиброматоз). Обнаружено, что мутации в локусах АРС и NF-1 в клетках зародышевых линий связаны с возникновением вначале доброкачественных опухолей, а затем карцином. Наследуемая утрата одного аллеля гена АРС приводит к развитию множественных полипов кишки во второй—третьей декадах жизни (семейный полипоз и синдром Гарднера, E.J.Gardner). Часть полипов позднее малигнизируется.

Помимо упомянутых случаев малигнизации полипов (семейный полипоз толстой кишки), мутации гена АРС найдены при обычных (ненаследственных) аденомах и карциномах этого органа. Причем только в 30 \% наблюдений отмечена гомозиготная утрата гена АРС. Поэтому инактивация аллелей, возможно, и не нужна для развития опухолей. Следует также добавить, что утрата гена АРС встречается и при некоторых карциномах желудка и поджелудочной железы.

Ген NF-1 отличается сходным механизмом действия. Лица, наследующие его мутантный аллель, имеют множественные доброкачественные нейрофибромы, часть которых может прогрессировать до нейрофибросарком.

Ген D С С (deleted in colon carcinoma, т.е. ген, подвергающийся делеции при раке кишки) — это обозначение относится к гену, картированному в позиции 18q21. Подобно другим кан-церосупрессорным генам этот ген был идентифицирован благодаря частой утрате гетерозиготности при раке кишечника. Недавно его делеции (утраты последовательностей нуклеотидов ДНК) были обнаружены также при карциномах желудка.

Ген W Т-1. Функция этого опухолевого гена-супрессора, расположенного в позиции 11р13, предрасполагает к развитию нефробластомы Вильмса. Как и ретинобластома, эта опухоль встречается и в наследственной, и в спорадической формах. Однако в отличие от ретинобластомы, кроме утраты WT-1, бывают делеции и других канцеросупрессорных генов, расположенных на участках хромосом 11р15 и I6ql3.

Завершая раздел об опухолевых генах-супрессорах, нужно перечислить их важнейшие биохимические функции. Полагают, что эти гены кодируют различные продукты, способные тормозить пролиферацию. Ген DCC кодирует трансмембранный белок, напоминающий молекулы клеточной адгезии, участвующие в межклеточных или клеточно-матриксных взаимодействиях. Поэтому, весьма вероятно, что продукт этого гена участвует в передаче негативных сигналов для контактного торможения (по R.S.Cotran, V.Kumar, T.Collins, 1998). Другой возможной точкой приложения продуктов генов-супрессоров, в частности NF-1, является ослабление регуляции сигналов-дериватов факторов роста. Третье приложение предположительно связано с молекулами, регулирующими транскрипцию. В итоге все позитивные или негативные сигналы достигают ядра клетки, от которого и зависит деление клетки. Поэтому именно в ядре расположены продукты некоторых генов-супрессоров (Rb, WT-1, Р53).

Недавно выдвинута гипотеза о регуляции клеточного цикла белком гена Rb (pRb). В основе этого механизма лежит способность онкобелков, например, продукта гена вируса папилломы

SV40, связываться с нефосфорилированной формой pRb и ней-трализовывать ее действие, что тормозит переход клетки из фазы G0 или G, в митоз.

Известно, что р53, как и Rb, является ядерным фосфопроте-идом, регулирующим репликацию ДНК, пролиферацию и гибель клетки. Полагают, что именно он может препятствовать распространению в ткани генетически поврежденных клеток. В норме биологический полупериод существования этого гена в клеточном цикле исчисляется минутами, а доказательства его участия в делении клетки отсутствуют. Но как только клетка подвергается воздействию мутагенных агентов (химикаты, облучение), р53 стабилизируется через свои посттрансляционные модификации и накапливается в ядре. Накопленный нормальный или дикий р53 (см. главу 8) связывается с ДНК и вызывает задержку клеточного цикла в фазе G,. Эта задержка необходима, так как способствует репарации ДНК в зонах генетических повреждений. Помимо этого, р53, минуя этот путь, может включать в мутантных клетках механизм апоптоза. Поэтому этот ген называют «молекулярным полицейским» или «стражником генома». При его утрате, которая встречается при многих опухолях, репликации поврежденной ДНК и мутации становятся в геноме фиксированными. Несмотря на то что какая-либо единственная мутация еще не трансформирует клетку, утрата р53 предрасполагает клетку к нескольким мутациям и в конце концов к малигнизации. Открыта еще одна функция р53 не как гена-супрессора, а как онкогена. Дело в том, что некоторые его мутантные формы, подобно другим онкогенам, трансформируют клетки in vitro. Оказалось, что эти мутантные формы не только теряют свою нормальную функцию, но и способны к связыванию и инактивации нормального протеина р53. При этом клетка с одним мутантным и одним нормальным аллелями ведет себя так, словно функция р53 отсутствует вообще. Мутации такого типа называются доминантно-негативными, поскольку мутантная аллель подавляет нормальную. Сходным образом может проявлять себя и ген АРС.

Гены, регулирующие апоптоз. Совсем недавно понимание молекулярных механизмов канцерогенеза основывалось главным образом на функции онкогенов и опухолевых генов-суп-рессоров. Несмотря на радикальные отличия их функций, представители обоих этих классов так или иначе регулируют пролиферацию клеток. И лишь недавно выяснилось, что гены, предотвращающие или вызывающие программированную гибель клеток, тоже являются важными изменчивыми субстанциями для канцерогенеза.

Все это выяснилось вскоре после открытия гена bcl-2. Его изучение началось с установления того факта, что около 85 \% фолликулярных В-клеточных лимфом (см. главу 13) сопровождаются характерными транслокациями: t (14; 18) и (q32; q21).

Локус 14q32 — место обнаружения генов, ответственных за синтез иммуноглобулинов тяжелых цепей, — также вовлекается в опухолевый процесс при лимфоме Беркитта. Близкое соседство этого активного локуса с геном bcl-2, локализованным на 18q21, вызывает сверхэкспрессию белка bcl-2. С помощью пока неясного механизма ген bcl-2 предотвращает программированную гибель клеток. Предположительно сверхэкспрессия bcl-2 допускает и другие мутации, после чего появляются протоонкогены и канцеросупрессорные гены. Например, у трансгенных мышей с геном bcl-2, пересаженным от человека и подвергшемся сверхэкспрессии, первоначально развивается поликлональная В-кле-точная пролиферация, которая после долгого латентного периода переходит в агрессивную моноклональную злокачественную лимфому.

У гена bcl-2 необычна не только функция, но и локализация: внутренняя мембрана митохондрий, оболочка ядра, цистерны эндоплазматической сети. Его действие изучено недостаточно. Полагают, что во многих случаях апоптоз происходит в результате летальных повреждений, вызванных реактивной разновидностью кислорода, a bcl-2 тормозит апоптоз с помощью регуляции антиоксидантной системы (тормозящей окисление). Поскольку bcl-2 может предотвращать апоптоз, возникает вопрос, имеются ли гены с противоположным действием, т.е. вызывающие программированную гибель клеток? Хотя с-тус традиционно рассматривался как транскрипционный активатор, способствующий пролиферации, недавно стало известно, что если клетки со сверхактивным с-тус не имеют в своем микроокружении достаточного количества факторов роста, они претерпевают апоптоз. Но если в таких клетках bcl-2 находится в состоянии сверхэкспрессии, апоптоз не наступает. Таким образом, пока оба гена bcl-2 и с-тус действуют содружественно, активация последнего, например, при транслокации, является летальной.

Молекулярные  основы  многоступенчатого канцерогенеза.

Представление о том,.что злокачественные опухоли возникают в результате ряда событий (стадийных изменений) в ткани, основано на эпидемиологических, экспериментальных и молеку-лярно-биологических исследованиях. Выделяют две основные стадии канцерогенеза: инициации (начальной опухолевой трансформации генома клеток) и промоции (реализации опухолевого фенотипа). Учение об онкогенах и генах-супрессорах заложило прочную основу под концепцию многоступенчатого канцерогенеза.

Опыты с трансфекцией ДНК показали, что какой-либо единственный онкоген (myc, ras и др.) не способен in vitro полностью трансформировать клетку, однако, действуя содружественно, они могут это сделать. Такая кооперация необходима, поскольку функции каждого онкогена специализированы, и они формируют только часть нового гено- и фенотипа, необходимую для полной трансформации. Например, онкоген ras стимулирует выработку факторов роста клетками и приспосабливает последних к росту без прикрепления к нормальному субстрату (при так называемой независимости от прикрепления). В то же время онкоген туе приводит клетки в состояние, чувствительное к факторам роста, а также иммортализует их, т.е. делает бессмертными.

При каждой злокачественной опухоли происходят множественные генетические изменения, включающие в себя активацию нескольких онкогенов и утрату двух или более канцеросу-прессорных генов. Каждое из этих изменений является по существу решающей ступенью в прогрессии от нормальной клетки к злокачественной опухоли. В качестве примера нередко приводят модель эволюции гено- и фенотипических изменений при колоректальном канцерогенезе. Первой ступенью является инактивация опухолевого гена-супрессора АРС, происходящая вследствие его утраты или мутации на хромосоме 5q. Все это сопровождается гиперплазией нормального кишечного эпителия. Далее вслед за прекращением метилирования ДНК происходит формирование ранней аденомы. Затем мутация гена ras на хромосоме 12р приводит к развитой аденоме, а утрата гена DCC на хромосоме 18q — к поздней аденоме с разными степенями дис-плазии эпителия. Наконец, утрата гена р53 на хромосоме 17р завершается возникновением карциномы толстой кишки.

Возникает вопрос, появляются ли указанные множественные мутации в малигнизированных клетках независимо друг от друга или в результате генетического повреждения одного или нескольких контрольных генов? Хотя исчерпывающий ответ на этот вопрос еще предстоит получить, следует упомянуть о наличии гена, картированного в позиции 2р15—16. Он регулирует или влияет на мутации сотен, а, возможно, и тысяч других локу-сов. Поскольку этот ген был открыт при изучении наследственного рака толстой кишки, не связанного с полипозом, он был назван FCC (familial colon carcinoma gene). Примерно ІЗ \% случаев спорадического рака толстой кишки сопровождаются мутациями этого гена. Его продукт участвует в репарации ДНК. Когда осуществляется копирование нити ДНК, белок гена FCC действует как «контролер составления». Если случается ошибка, нарушающая спаривание оснований (например, G с Т вместо нормального спаривания А с Т), то ген FCC направляет механизм репарации ДНК на соответствующее исправление. Без такого контролера составления ошибки накапливаются в нескольких генах, в том числе и в тех, которые регулируют пролиферацию клеток.

Изменения кариотипа в опухолевой ткани. Генетические изменения, активирующие онкогены или инактивирующие гены-супрессоры, могут быть почти неуловимыми, как точковые мутации, или достаточно объемными, чтобы определить их в кари-отипе. В некоторых новообразованиях нарушения кариотипа носят неслучайный характер и встречаются часто. Вполне специфичные для каждого вида опухоли нарушения (аберрации) идентифицированы в клетках большинства вариантов лейкемий и лимфом, а также во все увеличивающемся количестве опухолей из некроветворной ткани. Обычными типами неслучайных структурных аберраций в опухолевых клетках признаны: уравновешенные транслокации, делеции, цитогенетические проявления амплификации генов (о выявлении и обозначении аберраций см. главу 1). Кроме того, может быть увеличена или целиком утрачена вся хромосома.

Изучение изменений хромосом, происходящих в опухолевых клетках, имеет важное значение. Во-первых, молекулярное клонирование генов, расположенных по соседству от мест разрыва или делеции той или иной хромосомы, оказалось крайне важным при идентификации онкогенов (bcl-2, c-abl и др.) и генов-супрессоров (АРС, Rb и др.). Во-вторых, определенные нарушения кариотипа настолько специфичны, что имеют диагностическую, а в ряде случаев и прогностическую ценность. При диагностике новообразований часто пользуются результатами исследований аберраций хромосом.

Уравновешенные транслокации часто встречаются в онкологической практике, особенно в опухолях из кроветворных тканей. Наиболее известна филадельфийская хромосома (Рп1), образующаяся при хронической миелоидной лейкемии в результате реципрокной (обоюдной) и уравновешенной транслокации между хромосомами 22 и, как правило, 9. Вследствие этого хромосома 22 выглядит несколько укороченной. Эти изменения обнаруживаются более чем у 95 \% больных миелоидной лейкемией и считаются надежным маркером заболевания.

У более чем 90 \% больных с лимфомой Беркитта в опухолевых клетках встречается транслокация между хромосомами 8 и 14. При фолликулярной В-клеточной лимфоме часто обнаруживается реципрокная транслокация между хромосомами 14 и 18.

Делеции являются вторым наиболее частым структурным изменением кариотипа в опухолях человека (глава 8). По сравнению с транслокациями они распространены в опухолях, развивающихся из некроветворных тканей. Как уже подчеркивалось, делеции хромосомы I3q в полосе 14 бывают при рети-нобластоме. Делеции 17р, 5q и 18q, обнаруживаемые при коло-ректальных карциномах, инактивируют три опухолевых гена-супрессора. Делеция Зр чрезвычайно распространена в мелкоклеточных карциномах легкого и почечно-клеточном раке. Еще одним примером служат делеции 1р в полосах 11—12, обнаруживаемых при злокачественных меланомах, аденокарциноме молочной железы и мезотелиоме плевры.

Амплификации генов. Известны два проявления такой амплификации: сдвоенные мелкие частицы (dms) и гомогенно окрашенные районы (HSRs) на одной хромосоме. Наиболее характерными примерами таких изменений являются нейроблас-томы и карциномы молочной железы, при которых амплификации подвергаются соответственно гены N-myc и c-erb В2.

Укорочение теломер, т.е. концевых отделов плеча хромосомы. Нормальные клетки способны к делению всего несколько десятков раз. Затем они погибают. Полагают, что при каждом делении происходит некоторое укорочение важных отделов хромосом, а затем их восстановление с помощью фермента те-ломеразы. Фермент вырабатывается под контролем гена хЕСТ2, функции которого ограничены пределами определенного количества митозов. У малигнизированных клеток активированный ген хЕСТ2 способен постоянно вырабатывать теломеразу. Тогда укорочение теломер и гибель беспрерывно размножающихся клеток не происходят. Так (согласно гипотезе об укорочении теломер), обеспечивается бессмертие малигнизированных клеток in vivo.

Изменения плоидности ДНК. Речь идет о суммарной количественной оценке содержания ДНК путем сравнения с таковым при нормальном диплоидном наборе из 46 хромосом. Обычно сравнивают ядра опухолевых клеток и нормальных лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль с помощью проточной цитометрии (см. главу 1). Более 70 \% злокачественных новообразований имеют ненормальное содержание ДНК. Это означает, что они анэуплоидны. Состояние анэуплоидии опухолевых клеток может быть следствием недостаточной способности хромосом или хроматид (копий хромосом, образующихся при репликации) к разъединению в анафазе клеточного деления. Оно может быть также обусловлено задержкой передвижения хромосом в анафазу. В любом случае деление произойдет, но одна из дочерних клеток будет иметь лишнюю копию хромосом (трисомию), другая — недостающую копию (моносомию). В малигнизированных клетках бывает и большее количество копий (полиплоидия). Нормальный диплоидный набор обозначают символом 2с. Показано, что если опухолевая популяция имеет признаки анэуплоидии, а средний статистический индекс содержания ДНК в ней свидетельствует о полиплоидии и превышает уровень 5с (глава 8), то это является плохим прогнозом.

 

Страница: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 |